论文导读：以饮食失节（脂食为主）复制脾虚动物模型及应用双价酵母等治疗，与自然恢复组、正常组进行全身各系统形态学观察，结果证实脾虚证具有消化系统为主的特定病变，并对胰，肝、胃、小肠的组织化学和超微结构变化进行观察。第2组为脾虚组，第3-5组在第11-20天分别以普通酵母、酵母细胞壁、双价酵母治疗，第6组为自然恢复组。造模及治疗后分别拉颈处死小鼠，取全身各脏器作病理形态学检查，重点观察胰、肝、胃、小肠的电镜（透射和扫描）和组织化学。肠道免疫是粘膜免疫系统的主要部分，肠腔内的抗原与淋巴组织相互作用主要部位是小肠Pcycr淋巴集结。同时Peyer淋巴集结中被激活、增殖的淋巴细胞通过淋巴系统进人血流到其他器官如呼吸道、生殖道、乳腺等发挥全身粘膜系统免疫作用，故M细胞的质与量在肠道免疫及全身粘膜系统免疫作用中极为重要。

　　关键词：脾虚动物模型，双价酵母，组织化学，超微结构，肠道免疫，粘膜系统免疫

　　以饮食失节（脂食为主）复制脾虚动物模型及应用双价酵母等治疗，与自然恢复组、正常组进行全身各系统形态学观察，结果证实脾虚证具有消化系统为主的特定病变，并对胰，肝、胃、小肠的组织化学和超微结构变化进行观察。

　　1 材料与方法

　　1 1 药物

　　普通酵母、酵母细胞壁、双价酵母（海南正强生化技术开发有限公司公司生产，批号：2008-1）

　　1.2 动物与分组

　　1.2.1 造模动物

　　健康Balb/c小鼠，雌雄各半，体重20-21g，鼠龄8周，60只小鼠随机分成6组，每组10只。第1组为正常对照组，余50只为造模组。1Od后造成脾虚证动物模型。第2组为脾虚组，第3-5组在第11-20天分别以普通酵母、酵母细胞壁、双价酵母治疗，第6组为自然恢复组。

　　1.2.2 造模方法

　　小鼠在室温喂养，自由饮水。正常对照组喂专用饲料配方制成的硬饲料，造模组喂甘蓝（清水洗净后过锰酸钾液消毒），隔日喂猪脂（不限量）。每组喂养10d，逐日称体重，记录精神状态，活动情况毛色、肛门及粪便等。

　　1.3 治疗方法

　　5组小鼠均用灌胃法灌注，按小鼠每克体重用药相当于临床用药30倍用量，第3组用双价酵母，第4组用普通酵母，第5组用酵母细胞壁，第6组用蒸馏水每鼠均用0.5ml，每晨1次。

　　1.4 观察方法

　　造模及治疗后分别拉颈处死小鼠，取全身各脏器作病理形态学检查，重点观察胰、肝、胃、小肠的电镜（透射和扫描）和组织化学。

　　1.4.1 透射电镜

　　胰、胃、十二指肠粘膜经2.5%-5% 戊二醛固定（4C），缓冲液浸洗。1%锷酸后固定，70 乙醇醋酸铀块染，逐级乙醇及丙酮脱水，Epon812包埋，半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位，LKB8800型超薄切片机切400- 700A0薄片，拘椽酸铅复染置JEM-1200EX型透射电镜观察。

　　1.4.2 扫描电镜

　　取小鼠空肠和胃肠系膜对侧寻找肉眼勉强可见的Peyer淋巴集结组织块，以2.5%戊二醛固定，PBS洗涤，1%锷酸后固定，梯度乙醇及纯醋酸乙酯脱水，临界点干燥，BB-5型离子镀膜机喷金镀膜，置Phylips SEM505型扫描电镜下观察，计数圆顶区（淋巴滤泡）上的M细胞数。

　　1.4.3 组织化学

　　各组随机选5只小鼠的胰、肝、胃、十二指肠新鲜组织不经固定，低温冰冻切片6-8Um作组织化学；三磷酸腺苷酶（ATP酶）、琥珀酸脱氢酶（SDH酶）、苏丹II脂肪染色；肝及肌肉以无水乙醇固定，作PAS过碘酸雪夫法糖原染色检查。显色按浓淡分6级（-～++++〕

　　1.5 统计学处理方法

　　采用组间t检验。组织化学按显色浓淡分6级（-、±、+、++、+++、++++）比较差异。

　　2 结果

　　2.l 一般表现及体重

　　造模组造模前与正常组体重无明显差异[（20+1）g ,（16.5±1.2） g]，造模后脾虚组体重明显低于正常组[（15.4±2.7）g ,（20.8±1.1）g]。造模后第3天即见纳少、少动；第5天见蜷缩、竖毛、大便稀烂；第7天见群聚、怕冷、无力、大便溏泄、脱肛；第10天均卧倒、闭目不动、皮色黄白、大便见隐血。经双价酵母等灌药后食欲增进，活力增强，体重增加，毛发光泽大便成形隐血阴性。自然恢复组比前3组差。

　　2.2 透射电镜

　　2.2.1 胰腺正常组胰外分泌部腺泡上皮酶原颗粒甚多，细胞较大，腺泡周围毛细血管网丰富与内分泌部胰岛血窦和毛细血管球相连，无淤血，胰内分泌部（胰岛）见B细胞（贮存颗粒平均直径、下同345 nm）较多，具有1个或以上的圆形或多角形结晶状核心（内含浓缩胰岛素）与界膜之间呈不规则空晕。颗粒成熟者核心密度增高，空晕加宽，A细胞（350 nm ）颗粒核心密度高、呈圆形，居中或偏位，核心与界膜间为“灰色晕”：D细胞（375 nm）颗粒核心圆形，密度中等，紧贴界膜。空晕极窄或不见。论文参考网。脾虚组胰腺泡上皮内酶原颗粒明显减少，腺泡腔内和上皮细胞及其胞核内均可见到大肠杆菌感染的菌体存在，上皮内线粒体退变，板层体增多，腺泡周围毛细血管网减少，淤血明显，内分泌部胰岛内日细胞数及其颗粒减少，结晶核心密度减低，内含胰岛素甚少或缺乏，A及D细胞减少。双价酵母组内、外分泌腺同正常组。普通酵母组除淤血未完全消失外，余均正常。酵母细胞壁组内、外分泌腺恢复差，咦腺泡上皮酶原颗粒仍不足，胰岛细胞数稍见增多，不如双价酵母组。酵母细胞壁组胰腺泡上皮酶原颗粒同双价酵母组，但胰岛细胞仍略少，尚未恢复。自然恢复组基本病变同脾虚组。

　　2.2.2 胃肠正常组见胃粘膜上皮为单层柱状上皮，胞质内粘原颗粒适中。其微绒毛完整无缺损，胃底腺颈粘液细胞内粘原颗粒适中。主、壁细胞数量适中，上细胞核上方胞质含膜包裹的酶原颗粒较多壁细胞内小管（为合成盐酸处）的腔面有较多的微绒毛胃腺促胃泌素细胞（G细胞）甚多，呈梨状，胞底侧胞质中有密集的分泌颗粒，呈圆形、椭团形。150-10 nm，其他各种内分泌细胞如D细胞、AL细胞也多，十二指肠粘膜表面绒毛甚多，其表面为单层吸收上皮和杯状细胞，吸收上皮游离面为排列紧密的微绒毛，其细胞间隙封闭呈屏障状。杯状细胞胞质内充满粘原颗粒，高尔基复合体及粗面内质网适中固有摸内淋巴、浆细胞少，毛细血管无淤血，其肠腺基底部有较多潘氏细胞及少数G、D细胞等内分泌细胞。论文参考网。脾虚组见胃粘膜上皮细胞及胃底腺颈粘液细胞内粘原颗粒较多，微绒毛减少。主及壁细胞，G细胞明显减少，其中分泌颗粒也少，其他内分泌细胞更少或未见。十二指肠吸收上皮微绒毛减少，杯状细胞内粗面、内质网、高尔基复合体少，粘原颗粒极少，各种内分泌细胞仅见甚少的G细胞，细胞间隙宽。固有膜淋巴、浆细胞多且痕血明显。自然恢复组的胃肠病变基本同脾虚组，固有膜可见纤维化，嗜酸细胞多但有些改善。双价酵母组、酵母细胞壁组病变基本恢复或与正常无异。普通酵母组仅接近正常。

　　2.3 扫描电镜

　　正常组可见有大小不等的圆顶区镶嵌于指状突起的绒毛丛中。每个Peyer淋巴集结约有4--10个直径250-450Um.高约50Um，表面平坦无绒毛覆盖，圆顶区上皮为二种单层柱状上皮细胞，一种为数量众多，具吸收上皮特征的整齐密集而细长的微绒毛；另一种数量较少，表面为稀疏、粗短、不规则微绒毛的微皱褶细胞，简称M细胞（它具有处理，传递肠腔抗原信息给淋巴细胞引起免疫反应的细胞。幼稚M细胞微绒毛整齐，粗短；成熟M细胞微绒毛更不规则，呈微皱褶或缺少。双价酵母组、酵母细胞壁组基本同正常组。普通酵母组M细胞比双价酵母组少，吸收上皮仅见少数，部分微绒毛呈乱、短、疏，绒毛稍有破损，圆顶区被掩。脾虚组绒毛丛倒伏糜烂，破损明显呈扁平状，圆顶区被掩没而减少，其中M细胞量也明显减少。微绒毛消失、稀少；吸收上皮微绒毛变短少，稀疏。自然恢复组基本同脾虚组。各组经计数3例9个圆顶区M 细胞，各组对比见表1

　　表1 各组M细胞与正常组及脾虚组比较

　　组别nM细胞个数

　　脾虚组914.1±5.01

　　自然恢复组915.6±4.11

　　正常组932.1±4.9

　　双价酵母组939.6±6.2

　　酵母细胞壁组930.1±5.6

　　普通酵母组928.1±4.7

　　2.4 组织化学

　　2.4 .1 ATP 酶 （ 活 性 显 黑 棕 色 沉 淀 ）酶活性见表2。

　　表2. 各组ATP酶活性

　　组别十二指肠绒毛部肠腺肝小叶

　　顶体基底部中央部周边部

　　脾虚组-++～+++++～+++++--～+

　　自然恢复组+～++++++++++++

　　正常组+～+++++++++++～+++～+++

　　双价酵母组+～++++++++～++++++++++

　　酵母细胞壁组+～++++++～+++++++

　　普通酵母组+～+++++++～++++++++++

　　2.4.2 SDH酶〔活性显兰色）各组SDH酶活性见表3

　　表3. 各组SDH酶活性

　　组别十二指肠绒毛部肠腺肝小叶

　　顶体基底部中央部周边部

　　脾虚组-+～++++～+++++--～+

　　自然恢复组+++++++++

　　正常组+～+++++++++～+++～+++

　　双价酵母组+～++++++++～++++++++++

　　酵母细胞壁组++++++～+++++++

　　普通酵母组+～+++++++～++++++++++

　　2.4.3 苏丹fl染色（显桔红色） 正常组，脾虚组，自然恢复组。说明脾虚组肝呈脂肪变；对脂肪肝有明显去脂作用；自然恢复组无甚变化

　　2.4.4 肝、肌糖原（PAS过碘雪夫法糖原染色显红色） 正常组、自然恢复组结果说明，正常组肝、肌糖原丰富；脾虚组治疗后，肝、肌糖原恢复正常。

　　3 讨论

　　脾虚小鼠在透射电镜中见胰腺上皮酶原颗粒明显减少，胰岛细胞（尤以B细胞）减少，其分泌颗粒减少，胰岛素分泌不足。胃主、壁细胞及G细胞均减少，其分泌颗粒减少。可使糖、脂肪、蛋白质的消化吸收、分解、合成、利用等代谢过程障碍，致组化显示有脂肪肝及肝、肌糖原缺乏，必然反映在血脂、血糖水平偏高或偏低以致平衡失调。由于十二指肠绒毛和吸收上皮微绒毛均缺损、减少，吸收面大大减少，致营养物质吸收不足，可致低蛋白血症引起消瘦等症十二指肠绒毛、肠腺、肝小叶及胰的组化中，ATP酶、SDH酶活性及肝、肌糖原减弱，说明脾虚小鼠物质代谢三梭酸循环产生能量明显不足。运用酵母等制剂通过透射电镜及组化酶活性观察均能缓解障碍。特别是双价酵母对降脂、脂肪肝有明显疗效，对糖代谢障碍所致血糖失衡和肝，肌糖原缺乏也有明显疗效，且对绒毛及微绒毛损伤起修补、恢复作用，致蛋白质、微量元素等消化吸收恢复正常，体重、体力增加此外脾虚小鼠吸收上皮细胞间隙加宽、腺体粘液细胞粘原颗粒过多。固有膜微循环淤血，肠道屏障功能降低，造成胰腺大肠杆菌感染。双价酵母使肠道屏障加强及微循环改善，使胰腺感染消失。肠道免疫是粘膜免疫系统的主要部分，肠腔内的抗原与淋巴组织相互作用主要部位是小肠Pcycr淋巴集结。它输出T,B淋巴细胞，其中B细胞产生SIgA，在肠道起局部免疫反应。每个Pcycr淋巴集结含4-10个淋巴滤泡其上有弯窿状结构称圆顶区，有M细胞可选择性吞噬、处理肠腔抗原，并将抗原信息传递给淋巴细胞摄取而引起免疫反应，其本身又为淋巴细胞的出人通道由于SIgA对各种微生物、毒素、大分子蛋白抗原可产生免疫排除反应，而其感应阶段即位于Pcycr淋巴集结上圆顶区的M细胞处。论文参考网。它与肠粘膜粘蛋白多糖层及粘液共同形成保护肠道的屏障。同时Peyer淋巴集结中被激活、增殖的淋巴细胞通过淋巴系统进人血流到其他器官如呼吸道、生殖道、乳腺等发挥全身粘膜系统免疫作用，故M细胞的质与量在肠道免疫及全身粘膜系统免疫作用中极为重要。脾虚者M 细胞少，经用双价酵母后，M细胞增多，因此更进一步阐明了双价酵母对脾虚复健及提高肠道、全身免疫的新机制。

　　参考文献

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